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Nature Communications volume 13, número do artigo: 4337 (2022) Citar este artigo

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Uma correção do editor para este artigo foi publicada em 13 de outubro de 2022

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Relatamos uma vacina candidata contra SARS-CoV-2 viva atenuada com (i) sequências reguladoras de transcrição viral reprojetadas e (ii) quadros de leitura abertos (ORF) 3, 6, 7 e 8 excluídos (∆3678). O vírus ∆3678 replica-se cerca de 7.500 vezes menos do que o SARS-CoV-2 de tipo selvagem em culturas primárias de vias aéreas humanas, mas restaura a sua replicação em células Vero-E6 deficientes em interferão que são aprovadas para produção de vacinas. O vírus ∆3678 é altamente atenuado em modelos de hamster e camundongos K18-hACE2. Uma imunização de dose única do vírus ∆3678 protege os hamsters do desafio e da transmissão do vírus do tipo selvagem. Entre as ORFs deletadas no vírus ∆3678, a ORF3a é responsável pela maior atenuação através do antagonismo da fosforilação de STAT1 durante a sinalização do interferon tipo I. Também desenvolvemos um vírus repórter mNeonGreen ∆3678 para neutralização de alto rendimento e testes antivirais. Em conjunto, os resultados sugerem que o ∆3678 SARS-CoV-2 pode servir como uma vacina candidata viva atenuada e uma ferramenta de investigação para potencial utilização no nível 2 de biossegurança.

A pandemia de COVID-19, causada pelo SARS-CoV-2, levou a mais de 513 milhões de infecções confirmadas e 6,2 milhões de mortes (em 1 de Maio de 2022; https://coronavirus.jhu.edu/). Diferentes plataformas de vacinas foram desenvolvidas com sucesso para a COVID-19, incluindo mRNA, vetor viral, subunidade proteica e vírus inativado. As vacinas vivas atenuadas do SARS-CoV-2 não foram ativamente exploradas, embora possam ter vantagens de baixo custo, forte imunogenicidade e durabilidade imunológica potencialmente longa1. O vírion SARS-CoV-2 consiste em um nucleocapsídeo interno, formado pelo RNA genômico revestido com proteínas do nucleocapsídeo (N), e um envelope externo, formado por uma membrana bilipídica derivada de célula embutida com espícula (S), membrana (M) e proteínas do envelope (E)2. O genoma de RNA viral de fita simples e sentido positivo codifica quadros de leitura abertos (ORFs) para dezesseis proteínas não estruturais que formam a maquinaria de replicação (ORF1a/ORF1b), quatro proteínas estruturais (S, E, M e N) e sete proteínas acessórias3. Embora as funções exatas das proteínas acessórias do SARS-CoV-2 ainda não tenham sido determinadas, estudos anteriores de outros coronavírus sugerem que estas proteínas não são essenciais para a replicação viral, mas podem modular a replicação e a patogénese através da interação com as vias do hospedeiro4,5,6,7, 8. Assim, a eliminação das proteínas acessórias poderia ser usada para atenuar o SARS-CoV-2.

Os coronavírus replicam e transcrevem RNAs subgenômicos (sgRNAs) através de um mecanismo de transcrição descontínuo que é mediado por sequências reguladoras de transcrição (TRSs). TRSs são sequências de nucleotídeos conservadas que estão localizadas perto da extremidade 5' do genoma e nas extremidades 5' das ORFs a jusante (Fig. 1a). Esses TRSs regulam a transcrição via emparelhamento de bases entre o TRS líder e os TRSs corporais que levam à produção de sgRNAs, que traduzem ORFs a jusante9,10,11. Dentro do TRS, uma sequência central de 6 a 8 nucleotídeos orienta a formação de pares de bases entre o RNA nascente e o TRS líder. Foi demonstrado anteriormente que a religação da sequência guia da rede SARS-CoV TRS poderia produzir um vírus atenuado. Esse SARS-CoV mutante de TRS poderia servir como uma abordagem de vacina viva atenuada para minimizar o risco de reversão12,13.

um diagrama esquemático para a construção de Δ678 e Δ3678 SARS-CoV-2. As deleções foram introduzidas na espinha dorsal da cepa USA-WA1/2020. As caixas verdes e vermelhas indicam as sequências TRS originais e mutadas, respectivamente. Promotor T7 T7, sequência líder L, sequências reguladoras da transcrição TRS; Quadro de leitura aberta ORF, gene da glicoproteína do envelope E, gene da glicoproteína da membrana M, gene do nucleocapsídeo N, região não traduzida UTR, caudas pA poli A. b Morfologias de placas de vírus WT, Δ678 e Δ3678 recombinantes. Os ensaios de placa foram realizados em células Vero-E6 e corados no dia 2,5 após a infecção. c – e Cinética de replicação de WT, Δ678 e Δ3678 SARS-CoV-2s em células Vero-E6 (c), Calu-3 (d) e HAE (e). Os vírus WT, Δ678 e Δ3678 foram inoculados em células Vero-E6, Calu-3 e HAE em MOIs de 0,01, 0,1 e 2, respectivamente. Após uma incubação de 2 horas, as células foram lavadas três vezes com DPBS e cultivadas continuamente sob FBS DMEM fresco a 2%. Os sobrenadantes da cultura foram medidos quanto aos títulos de vírus infecciosos utilizando ensaios de placas em células Vero-E6. f Níveis intracelulares de RNA WT, Δ678 e Δ3678 em células HAE no dia 7 pós-infecção. As células HAE foram lavadas com PDBS três vezes, lisadas com Trizol para isolamento de RNA, quantificadas para RNAs virais usando RT-qPCR. c – f Os pontos representam réplicas biológicas individuais (n = 3 para Vero-E6 e Calu-3; n = 5 para HAE). Os valores do gráfico representam a média ± desvio padrão. Um teste t bicaudal não pareado foi utilizado para determinar diferenças significativas entre os grupos WT e Δ678/Δ3678. Os valores de P foram ajustados usando a correção de Bonferroni para levar em conta comparações múltiplas. As diferenças foram consideradas significativas se p < 0,025. g de células HAE positivas para mNG após infecção com vírus mNG WT ou mNG Δ3678 em um MOI de 0,5. São mostradas imagens representativas de células positivas para mNG de três experimentos independentes; a baixa resolução das imagens positivas para mNG ocorreu porque a cultura HAE consistia em células vivas multicamadas em uma inserção plástica, que foi colocada em placas de 6 poços. Barra de escala, 100 μm. c–f Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.